Separace na chromatografické koloně
Rozlišení
Hlavním cílem chromatografické metody je dosáhnout dobrého rozdělení analyzovaných látek v přijatelném čase. Rozdělení látek může být dokonalé nebo nedokonalé a je vhodné tento stupeň kvantitativně vyjádřit. Rozlišení je pak nejpoužívanější vyjádření míry kvality separace dvou sousedních elučních křivek. Obecně je pak rozlišení definováno:
|
kde tR1 a tR2 jsou retenční časy složek 1,2 a Y1 a Y2 odpovídající šířky píků na úrovni nulové linie (ve stejných jednotkách).
Rozlišení se tedy udává jako rozdíl retenčních časů resp. objemů separovaných látek, dělený průměrnou hodnotu šířky elučních křivek. Rozlišení je veličina bezrozměrná a větší hodnota R znamená lepší separaci, při volbě separačních podmínek nejde však o dosažení co největšího rozlišení, ale o dosažení právě potřebného rozlišení.
Graficky lze rozlišení vyjádřit:
|
Výše uvedená rovnice nám neříká, jaké parametry ovlivní rozlišení. Lze odvodit rovnici, která se nazývá skutečná rovnice rozlišení. Z ní vyplývá, že rozlišení je ovlivněno třemi do značné míry nezávislými faktory. První člen - kinetický - účinnost - udává, že rozlišení je přímo úměrné druhé odmocnině z počtu pater kolony. Druhý člen - termodynamický - selektivita - udává, že rozlišení je přímo úměrné retenčnímu poměru a blíží se k nule, když se retenční poměr blíží k jedné. Třetí člen - kapacitní - udává, že rozlišení roste s rostoucí hodnotou kapacitního poměru a blíží se k nule, když se kapacitní poměr blíží nule:
|
Vliv chromatografických podmínek na eluční charakteristiky separovaných látek - vliv teploty naleznete zde
Vliv chromatografických podmínek na eluční charakteristiky separovaných látek vliv rozměrů kolony naleznete zde
Koeficinet separace - diskriminační faktor
Obecně kvalitnější mírou separace dvou sousedních elučních křivek než rozlišení R1,2 je koeficient separace, faktor rozlišení (discrimination factor).[1] Míra separace pomocí koeficientu separace do je definována jako poměr výšky píku menšího z dvojice sousedních píků hp ponížený o výšku údolí hv k celkové výšce píku hp:
|
Tento parametr se velmi jednoduše vypočte z každého chromatogramu:
|
Z rovnice je zřejmé, že koeficient separace závisí na relativní výšce píku a k baselinové separaci dochází v případě, že se koeficient separace do blíží jedné. Koeficient separace je v případě separace dvou píků o blízkém retenčním objemu a nestejné výšky píku, lepší parametr kvality separace dvou píků než rozlišení R1,2, které není závislé na výšce píku. Protože rozlišení není citlivé na relativní výšku eluční křivky a chyba při kvantifikaci závisí silně na lokalizaci údolí mezi oběma elučními křivkami, koeficient separace do je validní parametr charakterizující chybu v kvantitativní analýze. Chyba se může vyjádřit použitím frakční plochy Fa resp. frakční výškou Fh:
|
|
kde Ap,i resp. hp,i je plocha resp,, výška komponenty i, která je vypočtena z chromatogramu separace kritických píků, Ap,i0 resp. hp,i0 je plocha resp, výška píku, která je vypočtena z chromatogramu samotné látky. V případě, že se Fh (Fa) blíží jedné 1 pak se nevyskytuje žádná kvantitativní chyba.
Poměr výšky píku k údolí
Ve farmacii se zavádí k hodnocení míry separace tzv. poměr výšky píku k údolí (peak-to-valley ratio; p/v), který udává poměr výšky menšího píku Hp k výšce údolí Hv:
|
Poměr výšky píku k údolí p/v závisí na koncentraci analytu (výšce píku Hp) a vlastně nám nic neříká o míře separace. Pokud bude výška údolí Hv konstantní a bude se zvyšovat koncentrace (a pak i výška píku Hp), bude se zvyšovat p/v, ale míra separace bude pořád stejná.
Literatura
[1] Fallah M.Z. El., Martin M.: Chromatographia, 24, 115 (1987).
Last modified: