Separace látek s použitím 100 % vodných mobilních fází
Samotná voda jako mobilní fáze bez přídavku organického rozpouštědla dobře nevyhovuje, protože hydrofobní povrch reverzní fáze se dobře vodou nesmáčí a chromatografické chování látek je abnormální. Někdy dochází až k tzv. zhroucení chemicky vázané stacionární fáze - tzv. "hydrofobní kolaps" nebo také fázový kolapse (Phase Collapse). Samotná voda je složkou o velmi malé eluční síle. Opodstatnění použití samotné vody jako mobilní fáze je pouze u silně polárních látek jako jsou např. organické kyseliny, nukleotidy aj. Mnohé reverzní fáze C18 budou vykazovat reverzibilní ztrátu retence chromatografovaných látek. Rychlost a stupeň ztráty retence závisí na pokrytí volných zbytkových silanolových skupin (endcapping) a množství uhlíku v chemicky vázané polární fáze (carbon load). Se stoupajícím % množstvím uhlíku ve stacionární fázi a zvyšujícím se endcappingem stoupá náchylnost kolony k hydrofobnímu kolapsu, protože tyto kolony mají zcela hydrofóbní povrch stacionární fáze. V případě nutnosti separace látek s použitím mobilní fáze 100 % vody by se měly používat tzv. resistentní kolony s nízkým množstvím uhlíku ve stacionární fázi (< 13 %) a s nízkým pokrytím zbytkových silanolových skupin např. BondapakPak C18 (Waters),BetaBasic 18 (Keystone Scientific).
Obrázek č. 1 Fázový kolaps v RP-HPLC
a) Mobilní fáze MeOH-H2O b) mobilní fáze H2O
Převzato z LC•GC Europe October 2002
|
Ztráta retence je reverzibilní a k obnovení retence postačuje kolonu propláchnout mobilní fází s určitým obsahem organického rozpouštědla (minimálně 10 % acetonitrilu). Někdy postačuje použít mobilní fázi s minimálním obsahem organického rozpouštědla (např. 0,1 % 2-propanolu). V poslední době se k obnovení retence používá promytí kolony za vysokého tlaku. Na výstup z kolony se připojí tzv. ucpávka tak, aby při průtoku 1 ml/min mobilní fáze obsahující 10 % acetonitrilu dosahoval tlak na koloně 5 000 psi. Po 1 minutě jsou retenční vlastnosti kolony již dostačující. Ztráta retence byla pozorována také při přerušení průtoku mobilní fáze obsahující 100 % vody. V případě, že je to možné, se doporučuje ponechat kolonu pod neustálým průtokem mobilní fáze. Nejlepším řešením v případě nutnosti použití 100 % vody jako mobilní fáze je použití reverzní fáze s modifikovaným ligandem (SymmetryShield (Waters), ABZ Plus (SUPELCO)). V tomto případě nedochází k hydrofobnímu kolapsu, někdy však změnou selektivitu dochází ke změně pořadí retence některých látek.
Související odkazy:
Last modified: