ÿþ<html> <head> <meta http-equiv=Content-Type content="text/html; charset=windows-1250"> <META name="keywords" content="HPLC, teorie, chromatografie, kolona, adsorbenty"> <title>HPLC teorie - Adsorbenty - Kolony</title> <style> <!--body {scrollbar-face-color: #FF0000; scrollbar-shadow-color: #00FFFF; scrollbar-highlight-color: #00FFFF; scrollbar-3dlight-color: #00FFFF; scrollbar-darkshadow-color: #00FFFF; scrollbar-track-color: #0000FF; scrollbar-arrow-color: #00FFFF;} /* Font Definitions */ @font-face {font-family:Tahoma; panose-1:2 11 6 4 3 5 4 4 2 4;} /* Style Definitions */ p.MsoNormal, li.MsoNormal, div.MsoNormal {margin:0cm; margin-bottom:.0001pt; font-size:10.0pt; font-family:"Tahoma";} --> </style> <script language="JavaScript"> <!-- function HighlightAnchor() { if (window.event.srcElement.tagName == "A") window.event.srcElement.style.color = "red"; } function LowlightAnchor() { if (window.event.srcElement.tagName == "A") window.event.srcElement.style.color = "blue"; } // --> </script> </head> <body lang=CS link=blue vlink=purple onmouseover="HighlightAnchor()" onmouseout="LowlightAnchor()"> <a name="_top"> <p><span style='font-size:12.0pt;font-family:Tahoma;color:blue'><b>Adsorbenty a chemicky vázané fáze</b></span></p> <p><span style='font-size:10.0pt;font-family:Tahoma;color:blue'><b><a href="#_1_Polar_sorbent">1. Polární adsorbenty</a></span></b></p> <p><span style='font-size:10.0pt;font-family:Tahoma;color:blue'><b><a href="#_2_Nepolar_sorbent">2. Nepolární adsorbenty</a></span></b></p> <p>&nbsp;</p> <p class=MsoNormal><span style='font-size:12.0pt;font-family:Tahoma;color:blue'><b><a name="_1_Polar_sorbent"></a><a href="#_top">1. Polární adsorbenty</a></b></span></p> <p><span style='font-size:10.0pt;font-family:Tahoma;color:blue'><b><a href="#_1_Silica">1.1 Silikagel (Silica)</a></span></b></p> <p><span style='font-size:10.0pt;font-family:Tahoma;color:blue'><b><a href="#_2_Oxid">1.2 Oxid hlinitý (Alumina)</a></span></b></p> <p><span style='font-size:10.0pt;font-family:Tahoma;color:blue'><b><a href="#_3_Chem_faze">1.3 Chemicky vázané polární stacionární fáze</a></span></b></p> <p>&nbsp;</p> <p class=MsoNormal><span style='font-size:10.0pt;font-family:Tahoma;color:blue'><b><a name="_1_Silica"></a><a href="#_top">1.1 Silikagel (Silica)</a></b></span></p> <p><span style='line-height:200%; font-size:10.0pt; font-family:Tahoma;margin-left:0.5cm'>Silikagel je obecn nejrozaíYenjaí polární sorbent. Kolony mají airoké komer ní vyu~ití. Silikagel lze pYipravit ve velmi isté form s rozn upravenými fyzikálními vlastnostmi. Pro ú ely HPLC se pYipravuje silikagel s pomrn velkým specifickým povrchem, který se pohybuje mezi 100 a~ 150 m<sup>2</sup>/g, velkým objemem póro (0,7 ml/g), stYední promr póro je asi 8-15 nm. Nej astjaí velikost áste ek nápln jsou 3, 5 a 10 µm. S rostoucím objemem póro klesá specifický povrch adsorbentu (V<sub>a</sub>) tím i distribu ní konstanta K<sub>D</sub> a následn retence chromatografovaných látek, selektivita dlení na velikosti specifického povrchu nezávisí.</p> <p><span style='line-height:200%; font-size:10.0pt; font-family:Tahoma;margin-left:0.5cm'>Aktivními centry na povrchu silikagelu jsou hydroxylové skupiny resp. silanolové skupiny Si-OH a existuje nkolik rozdílných typo silanolových skupin:</span></p> <td width=100%> <p align=center><img border=0 src="Figure/silica.gif"></p> </td> <p><span style='line-height:200%; font-size:10.0pt; font-family:Tahoma;margin-left:0.5cm'>Hydroxylové skupiny silikagelu jsou bu izolované, jednoduché, dvojité nebo jsou pYi vhodné poloze sousední skupiny vzájemn vázány vodíkovými vazbami. Rozmístní silanolových skupin na povrchu silikagelu závisí na zposobu zpracování silikagelu. PYi vysoké teplot dochází k odstranní silanolových skupin dvojitých a vázaných vodíkovým mostkem, dochází k ustálení jednoduchých a izolovaných silanolových skupin. Na silanolovou skupinu se adsorbuje vodíkovou vazbou rovn~ voda, kterou lze odstranit zahYátím na 150 °C a tím silikagel aktivovat, pYi teplot nad 200 °C dochází k ireverzibilním zmnám a za teploty 300-500 °C kondenzují sousední hydroxylové skupiny na siloxanové skupiny, které nelze pYi normální teplot hydratovat. PYi jeat vya-aích teplotách dochází k odatpení volných hydroxylových skupin a silikagel nabývá hydrofobních vlastností.</span></p> <p><span style='line-height:200%; font-size:10.0pt; font-family:Tahoma;margin-left:0.5cm'>Povrch silikagelu je slab kyselý, tak~e více zadr~uje bazické látky ne~ látky kyselé a neutrální a mo~e tak posobit jejich chvostování. Tomu lze zabránit pYídavkem slabé organické báze (vtainou aminového typu  triethylamin) do mobilní fáze, ale je nutné dbát, aby pH mobilní fáze nepYesáhlo pH 8, kdy dochází k rozpouatní silikagelu. Proto~e povrch silikagelu je kyselý, mo~e vystupovat jako iontomni .</span></p> <p class=MsoNormal><span style='font-size:10.0pt;font-family:Tahoma;color:blue'><b><a name="_2_Oxid"></a><a href="#_top">1.2 Oxid hlinitý (Alumina)</a></b></span></p> <p><span style='line-height:200%; font-size:10.0pt; font-family:Tahoma;margin-left:0.5cm'>Oxid hlinitý je krystalický se specifickým povrchem 100 a~ 200 m<sup>2</sup>/g, objemem póro 0,2 a~ 0,3 ml/g a promrem póro 10 a~ 20 nm. Hydroxylové skupiny se aktivují zahYíváním na 200 °C, pYi zahYívání nad 900 °C ztrácí oxid hlinitý aktivitu. Komer n dodávaný oxid hlinitý jako sorbent HPLC se aktivuje pYi teplot mezi 500 a 800 °C a pYeva~uje pak struktura <span style='font-family:Symbol'>g</span>-oxidu hlinitého (spinelová struktura).</span></p> <p><span style='line-height:200%; font-size:10.0pt; font-family:Tahoma;margin-left:0.5cm'>Vedle hydroxylových skupin jsou na povrchu oxidu hlinitého centra s elektron-akceptorovými vlastnostmi, které mohou vstupovat do interakce s molekulami bohatými na elektrony (Lewisovy báze). Tyto interakce jsou pYí inou ur itých rozdílo v selektivit oxidu hlinitého ve srovnání se silikagelem, který lze výhodnji pou~ít k dlení látek liaících se elektronovým rozlo~ením (polykondenzované aromáty s <span style='font-family:Symbol'>p</span>-elektronovým systémem). Primární pou~ití aluminy je v separaci nasycených a nenasycených alifatických uhlovodíko a separaci polyaromatických uhlovodíko. Jinak má alumina velmi podobné adsorp ní vlastnosti jako silikagel, je vaak mén pou~íván, proto~e na jeho povrchu dochází ke katalytickému atpení a rozkladu nebo ireverzibilní adsorpci chromatografovaných látek. Pro chromatografii se nejlépe hodí neutrální oxid hlinitý, který byl pYipraven neutralizací kyselinou. Bazický i kyselý oxid hlinitý vykazují vlastnosti mni e ionto, co~ vyvolává nepYíjemné komplikace pYi adsorp ní chromatografii.</span></p> <p class=MsoNormal><span style='font-size:10.0pt;font-family:Tahoma;color:blue'><b><a name="_3_Chem_faze"></a><a href="#_top">1.3 Chemicky vázané polární stacionární fáze</a></b></span></p> <p><span style='line-height:200%; font-size:10.0pt; font-family:Tahoma;margin-left:0.5cm'>Mezi dalaí normální fáze patYí chemicky vázané polární stacionární fáze: aminopropyl, kyanopropyl a diol, pentafluorfenylpropyl a mén pou~ívaný nitrofenyl. Retence na aminopropylu a diolu je srovnatelná s retencí na alumin, na kyanopropylu a nitrofenylu je retence ni~aí oproti pYedchozím fázím.</span></p> <p><span style='font-size:10.0pt;font-family:Tahoma;color:red'><b><a href="#_top">Aminopropyl</a></b></span></p> <p><span style='line-height:200%; font-size:10.0pt; font-family:Tahoma;margin-left:0.5cm'>Retence na <b><a href="Figure/aminopropyl.png" title="OtevYít ...">aminopropylu</a></b> je ve srovnání silikagelu a aluminy vyaaí a dobYe je mo~e substituovat. Jak mo~eme o ekávat, retence látek kyselé povahy na aminopropylu je daleko vtaí ne~ na silikagelu, kyanopropylu nebo diolu. Jako pYíklad je mo~no uvést separaci steroido s fenolickou funk ní skupinou, které jsou na této fázi daleko více zadr~ovány ne~ na silikagelu. Nevýhodou aminopropylu je jeho vysoká reaktivita a mo~e reagovat s aldehydy nebo ketony za vzniku imino, nebo mo~e být funk ní skupina NH2 oxidována napY. peroxidy. V pYítomnosti vody dochází k áste né hydrolýze NH2 skupiny a výsledkem je vysoké alkalické prostYedí v pórech, které se mo~e pohybovat a~ kolem hodnoty pH 10 a vyaaí a dochází k rozpouatní silikagelu. V tomto pYípad i pYi dostate n dlouhé ekvilibraci kolony se nedosáhne úplné regenerace a takto ekvilibrovaná fáze není srovnatelné s originální fází. Proto je nutné se vyhnout promývání aminopropylové fáze vodou.<sup><a href="#_edn1" name="_ednref1">[1]</a></sup></span></p> <p><span style='font-size:10.0pt;font-family:Tahoma;color:red'><b><a href="#_top">Pentafluorfenylpropyl</a></b></span></p> <p><span style='line-height:200%; font-size:10.0pt; font-family:Tahoma;margin-left:0.5cm'><b><a href="Figure/pentafluorfenylpropyl.png " title="OtevYít ...">Pentafluorfenylpropylvá fáze</a></b> je vhodná zejména pro <span style='font-family:Symbol'>p</span>-donor/<span style='font-family:Symbol'>p</span>-akceptorové interakce s vhodným analytem. Separace na pentafluorfenylpropylvé fázi je obdobná jako na oktadecylové fázi pouze je nutné pou~ívat mobilní fáze o silnjaí elu ní síle. Stacionární fáze vykazuje vyaaí selektivitu vo i aromatickým solutom. Na tchto fázích je mo~né pou~ívat 100 % vodné mobilní fáze bez zhroucení stacionární fáze v rozmezí pH 2,0 - 8,0 do teplot a~ 70 °C.</span></p> <p class=MsoNormal><span style='font-size:12.0pt;font-family:Tahoma;color:blue'><b><a name="_2_Nepolar_sorbent"></a><a href="#_top">2. Nepolární adsorbenty</a></b></span></p> <p><span style='font-size:10.0pt;font-family:Tahoma;color:blue'><b><a href="#_1_CVNSF">2.1 Chemicky vázané nepolární stacionární fáze</a></span></b></p> <p><span style='font-size:10.0pt;font-family:Tahoma;color:blue'><b><a href="../Tip/silanol.htm">2.2 Vliv aktivity zbytkových silanolových skupin (endcapping)</a></span></b></p> <p><span style='font-size:10.0pt;font-family:Tahoma;color:blue'><b><a href="../Tip/retence_polar.htm">2.3 Retence polárních látek v reverzním módu</a></span></b></p> <p>&nbsp;</p> <p class=MsoNormal><span style='font-size:10.0pt;font-family:Tahoma;color:blue'><b><a name="_1_CVNSF"></a><a href="#_top">2.1 Chemicky vázané nepolární stacionární fáze</a></b></span></p> <p><span style='line-height:200%; font-size:10.0pt; font-family:Tahoma;margin-left:0.5cm'>Stacionární fáze chemicky vázané na nosi i mají proti kapalným fázím zakotveným na nosi i Yadu praktických výhod - nedochází k vymývání stacionární fáze z nosi e ani jejímu áste nému rozpouatní ve fázi mobilní, ani k mechanickému strhávání pYi velkém protoku mobilní fáze. Chemicky vázaná fáze je robustnjaí ke zmn teploty a slo~ení mobilní fáze - nedochází vlivem tchto parametro k poruaení rovnováhy na kolon a proto se mohou volit rozné pracovní podmínky a to jak slo~ení mobilní fáze tak zmny teploty na kolon.</span></p> <p><span style='line-height:200%; font-size:10.0pt; font-family:Tahoma;margin-left:0.5cm'>Stacionární chemicky vázané fáze etherového typu -Si-O-C mají charakter monomero a tento typ vazby (Halászovy kartá e) není stabilní vo i hydrolýze a uvedené nápln mají omezené pou~ití (v mobilní fázi nesmí být pYítomna voda):</span></p> <td width=100%> <p align=center><img border=0 src="Figure/Si_1.png"></p> </td> <p style='text-align:justify;line-height:200%'><span style='font-size:10.0pt; line-height:200%;font-family:Tahoma'>Stacionární chemicky vázaná fáze -Si-N-C (2) je stabilnjaí k hydrolýze (pH 4 a~ 7,5):</span></p> <td width=100%> <p align=center><img border=0 src="Figure/Si_2.png"></p> </td> <p style='text-align:justify;line-height:200%'><span style='font-size:10.0pt; line-height:200%;font-family:Tahoma'>Zcela odolné k hydrolýze je tYetí typ vazby -Si-O-Si-C:</span></p> <td width=100%> <p align=center><img border=0 src="Figure/Si_3.png"></p> </td> <p><span style='line-height:200%; font-size:10.0pt; font-family:Tahoma;margin-left:0.5cm'>Reakcí silanolových skupin Si-OH s alkoholy pYímo, nebo chlorovaného silikagelu s aminy nebo reakcí s alkylchlorsilany vzniká chlorovodík, který je tYeba vázat triethylaminem nebo pyridinem.<sup><a href="#_edn2" name="_ednref2">[2]</a></sup> V pYípad reakce alkylchlorsilanu je R<sub>2</sub> ligand (R<sub>1</sub> a R<sub>3</sub> mohou být dalaí funk ní skupiny, které se mohou dále vázat se silanolovou skupinou). Podle názvu ligandu R pak odvozujeme typy stacionární fáze, které se vyzna ují roznou polaritou a tím rozdílnou selektivitou (C8, C18, fenyl, alkylfenyl):</span></p> <td width=100%> <p align=center><img border=0 src="Figure/stationary_phase.png"></p> </td> <p style='text-align:justify;line-height:200%'><span style='font-size:10.0pt; line-height:200%;font-family:Tahoma'>Pou~itím fenylové nebo alkylfenylové (napY. hexylfenyl) stacionární fáze dochází ke zvýaení retence soluto a sou asn dochází ke zmn selektivity aromatických slou enin (vliv <span style='font-family:Symbol'>p</span>-<span style='font-family:Symbol'>p</span> interakce mezi stacionární fází a solutem). Pou~itím alkylfenylových fází se jedná vlastn o kombinaci vlastností alkylových a fenylových fází, jsou napY. vhodné pro separaci nasycených a nenasycených vazeb ve sledovaném solutu.</span></p> <p style='text-align:justify;line-height:200%'><span style='font-size:10.0pt; line-height:200%;font-family:Tahoma'>Veli ina charakterizující chemicky vázanou fázi je stupeH pokrytí nosi e  tj. po et modifikovaných silanolových skupin <span style='font-family:Symbol'>c</span> (µmol/m<sup>2</sup>):</span></p> <td width=100%> <p align=center><img border=0 src="Figure/carbon_load.gif"></p> </td> <p style='text-align:justify;line-height:200%'><span style='font-size:10.0pt; line-height:200%;font-family:Tahoma'>kde SA je specifický povrch nosi e (m<sup>2</sup>/g), %C je procentický obsah uhlíku, který se získá elementární analýzou, nC je po et atomo uhlíku v molekule silanu (ligandu) a MW je molekulová hmotnost silanu pou~itého k chemické modifikaci nosi e. </span></p> <p style='text-align:justify;line-height:200%'><span style='font-size:10.0pt; line-height:200%;font-family:Tahoma'>Silikagel s volnými hydroxylovými skupinami obsahuje asi 8 µmol/m<sup>2</sup>, ale ze stérických dovodo mo~e zreagovat pouze asi polovina tchto volných silanolových skupin a chemicky lze tak vázat asi 4 µmol/m<sup>2</sup> silanu na povrchu silikagelu. Silaniza ní inidlo je pomrn objemné a ím objemnjaí je molekula silanu a ím delaí ligand obsahuje, tím se dosáhne ni~aího pokrytí povrchu nosi e (silikagelu) chemicky vázanou fází. Nezreagované silanolové skupiny jsou tedy áste n stínny sousedními ligandy nebo mohou být pYítomny separovaným molekulám. Nepolární fáze jsou zcela hydrofobní, jejich povrch se nesmá í vodou a nesmí obsahovat ~ádné silanolové skupiny pYístupné molekulám vzorku. Na náplních s nepolární fází musí být reten ní objemy polár-ních látek prakticky rovné mrtvému objemu kolony, reten ní objemy nepolárních látek na nepolárních fázích rostou s rostoucí délkou ligandu (alkylového Yetzce) a celkovým obsahem chemicky vázaného uhlíku (zvtauje se objem stacionární fáze).</span></p> <p><span style='line-height:200%; font-size:10.0pt; font-family:Tahoma;margin-left:0.5cm'> Dalaí související odkazy:</p> <p><b><a href="../Teorie/monolitic_columns.htm">1. Monolitické kolony</a></b><p> <p><b><a href="../Teorie/zir-chrom.htm">2. Kolony na bázi oxidu zirkoni itého</a></b><p> <p><b><a href="../Teorie/kolony_select.htm">3. Vybrané HPLC kolony</a></b></span><p> <p><b><a href="../Tip/silanol.htm">4. Vliv aktivity zbytkových silanolových skupin </a></b></span><p> <p><span style='font-size:10.0pt;font-family:Tahoma;color:blue'><a name="_Literatura"></a><b>Literatura</b></span></p> <hr size=2 width="55%" align=left> <p><span style='font-size:8.0pt;font-family:Tahoma'><a href="#_ednref1" name="_edn1">[1]</a>. Hara S., Ohnishi S.: J. Liq. Chromatogr. 7, 59 (1984).</span></p> <p><span style='font-size:8.0pt;font-family:Tahoma'><a href="#_ednref2" name="_edn2">[2]</a>. Karch K., Sebestian I., Halász I.: J. Chromatogr. 122, 3 (1976).</span></p> &nbsp; <!--- LAST MODIFIED ---> <p class=MsoNormal><b> <span style='font-size:8.0pt;font-family:"Monotype Corsiva";color:#FF0000'>Last modified: <script language="javascript"> <!-- datum = new Date (document.lastModified); mesic = new Array ('ledna', 'února', 'bYezna', 'dubna', 'kvtna', ' ervna', ' ervence', 'srpna', 'záYí', 'Yíjna', 'listopadu', 'prosince'); document.write (datum.getDate() + '. ' + mesic[datum.getMonth()] + ' ' + datum.getYear()); //--> </script> </span></b></p> <!--- LAST MODIFIED END---> </body> </html>