Adsorbenty a chemicky vázané fáze
1.3 Chemicky vázané polární stacionární fáze
Silikagel je obecně nejrozšířenější polární sorbent. Kolony mají široké komerční využití. Silikagel lze připravit ve velmi čisté formě s různě upravenými fyzikálními vlastnostmi. Pro účely HPLC se připravuje silikagel s poměrně velkým specifickým povrchem, který se pohybuje mezi 100 až 150 m2/g, velkým objemem pórů (0,7 ml/g), střední průměr pórů je asi 8-15 nm. Nejčastější velikost částeček náplně jsou 3, 5 a 10 µm. S rostoucím objemem pórů klesá specifický povrch adsorbentu (Va) tím i distribuční konstanta KD a následně retence chromatografovaných látek, selektivita dělení na velikosti specifického povrchu nezávisí.
Aktivními centry na povrchu silikagelu jsou hydroxylové skupiny resp. silanolové skupiny Si-OH a existuje několik rozdílných typů silanolových skupin:
Hydroxylové skupiny silikagelu jsou buď izolované, jednoduché, dvojité nebo jsou při vhodné poloze sousední skupiny vzájemně vázány vodíkovými vazbami. Rozmístění silanolových skupin na povrchu silikagelu závisí na způsobu zpracování silikagelu. Při vysoké teplotě dochází k odstranění silanolových skupin dvojitých a vázaných vodíkovým můstkem, dochází k ustálení jednoduchých a izolovaných silanolových skupin. Na silanolovou skupinu se adsorbuje vodíkovou vazbou rovněž voda, kterou lze odstranit zahřátím na 150 °C a tím silikagel aktivovat, při teplotě nad 200 °C dochází k ireverzibilním změnám a za teploty 300-500 °C kondenzují sousední hydroxylové skupiny na siloxanové skupiny, které nelze při normální teplotě hydratovat. Při ještě vyš-ších teplotách dochází k odštěpení volných hydroxylových skupin a silikagel nabývá hydrofobních vlastností.
Povrch silikagelu je slabě kyselý, takže více zadržuje bazické látky než látky kyselé a neutrální a může tak působit jejich chvostování. Tomu lze zabránit přídavkem slabé organické báze (většinou aminového typu – triethylamin) do mobilní fáze, ale je nutné dbát, aby pH mobilní fáze nepřesáhlo pH 8, kdy dochází k rozpouštění silikagelu. Protože povrch silikagelu je kyselý, může vystupovat jako iontoměnič.
Oxid hlinitý je krystalický se specifickým povrchem 100 až 200 m2/g, objemem pórů 0,2 až 0,3 ml/g a průměrem pórů 10 až 20 nm. Hydroxylové skupiny se aktivují zahříváním na 200 °C, při zahřívání nad 900 °C ztrácí oxid hlinitý aktivitu. Komerčně dodávaný oxid hlinitý jako sorbent HPLC se aktivuje při teplotě mezi 500 a 800 °C a převažuje pak struktura g-oxidu hlinitého (spinelová struktura).
Vedle hydroxylových skupin jsou na povrchu oxidu hlinitého centra s elektron-akceptorovými vlastnostmi, které mohou vstupovat do interakce s molekulami bohatými na elektrony (Lewisovy báze). Tyto interakce jsou příčinou určitých rozdílů v selektivitě oxidu hlinitého ve srovnání se silikagelem, který lze výhodněji použít k dělení látek lišících se elektronovým rozložením (polykondenzované aromáty s p-elektronovým systémem). Primární použití aluminy je v separaci nasycených a nenasycených alifatických uhlovodíků a separaci polyaromatických uhlovodíků. Jinak má alumina velmi podobné adsorpční vlastnosti jako silikagel, je však méně používán, protože na jeho povrchu dochází ke katalytickému štěpení a rozkladu nebo ireverzibilní adsorpci chromatografovaných látek. Pro chromatografii se nejlépe hodí neutrální oxid hlinitý, který byl připraven neutralizací kyselinou. Bazický i kyselý oxid hlinitý vykazují vlastnosti měniče iontů, což vyvolává nepříjemné komplikace při adsorpční chromatografii.
1.3 Chemicky vázané polární stacionární fáze
Mezi další normální fáze patří chemicky vázané polární stacionární fáze: aminopropyl, kyanopropyl a diol, pentafluorfenylpropyl a méně používaný nitrofenyl. Retence na aminopropylu a diolu je srovnatelná s retencí na alumině, na kyanopropylu a nitrofenylu je retence nižší oproti předchozím fázím.
Retence na aminopropylu je ve srovnání silikagelu a aluminy vyšší a dobře je může substituovat. Jak můžeme očekávat, retence látek kyselé povahy na aminopropylu je daleko větší než na silikagelu, kyanopropylu nebo diolu. Jako příklad je možno uvést separaci steroidů s fenolickou funkční skupinou, které jsou na této fázi daleko více zadržovány než na silikagelu. Nevýhodou aminopropylu je jeho vysoká reaktivita a může reagovat s aldehydy nebo ketony za vzniku iminů, nebo může být funkční skupina NH2 oxidována např. peroxidy. V přítomnosti vody dochází k částečné hydrolýze NH2 skupiny a výsledkem je vysoké alkalické prostředí v pórech, které se může pohybovat až kolem hodnoty pH 10 a vyšší a dochází k rozpouštění silikagelu. V tomto případě i při dostatečně dlouhé ekvilibraci kolony se nedosáhne úplné regenerace a takto ekvilibrovaná fáze není srovnatelné s originální fází. Proto je nutné se vyhnout promývání aminopropylové fáze vodou.[1]
Pentafluorfenylpropylvá fáze je vhodná zejména pro p-donor/p-akceptorové interakce s vhodným analytem. Separace na pentafluorfenylpropylvé fázi je obdobná jako na oktadecylové fázi pouze je nutné používat mobilní fáze o silnější eluční síle. Stacionární fáze vykazuje vyšší selektivitu vůči aromatickým solutům. Na těchto fázích je možné používat 100 % vodné mobilní fáze bez zhroucení stacionární fáze v rozmezí pH 2,0 - 8,0 do teplot až 70 °C.
2.1 Chemicky vázané nepolární stacionární fáze
2.2 Vliv aktivity zbytkových silanolových skupin (endcapping)
2.3 Retence polárních látek v reverzním módu
2.1 Chemicky vázané nepolární stacionární fáze
Stacionární fáze chemicky vázané na nosiči mají proti kapalným fázím zakotveným na nosiči řadu praktických výhod - nedochází k vymývání stacionární fáze z nosiče ani jejímu částečnému rozpouštění ve fázi mobilní, ani k mechanickému strhávání při velkém průtoku mobilní fáze. Chemicky vázaná fáze je robustnější ke změně teploty a složení mobilní fáze - nedochází vlivem těchto parametrů k porušení rovnováhy na koloně a proto se mohou volit různé pracovní podmínky a to jak složení mobilní fáze tak změny teploty na koloně.
Stacionární chemicky vázané fáze etherového typu -Si-O-C mají charakter monomerů a tento typ vazby (Halászovy kartáče) není stabilní vůči hydrolýze a uvedené náplně mají omezené použití (v mobilní fázi nesmí být přítomna voda):
Stacionární chemicky vázaná fáze -Si-N-C (2) je stabilnější k hydrolýze (pH 4 až 7,5):
Zcela odolné k hydrolýze je třetí typ vazby -Si-O-Si-C:
Reakcí silanolových skupin Si-OH s alkoholy přímo, nebo chlorovaného silikagelu s aminy nebo reakcí s alkylchlorsilany vzniká chlorovodík, který je třeba vázat triethylaminem nebo pyridinem.[2] V případě reakce alkylchlorsilanu je R2 ligand (R1 a R3 mohou být další funkční skupiny, které se mohou dále vázat se silanolovou skupinou). Podle názvu ligandu R pak odvozujeme typy stacionární fáze, které se vyznačují různou polaritou a tím rozdílnou selektivitou (C8, C18, fenyl, alkylfenyl):
Použitím fenylové nebo alkylfenylové (např. hexylfenyl) stacionární fáze dochází ke zvýšení retence solutů a současně dochází ke změně selektivity aromatických sloučenin (vliv p-p interakce mezi stacionární fází a solutem). Použitím alkylfenylových fází se jedná vlastně o kombinaci vlastností alkylových a fenylových fází, jsou např. vhodné pro separaci nasycených a nenasycených vazeb ve sledovaném solutu.
Veličina charakterizující chemicky vázanou fázi je stupeň pokrytí nosiče – tj. počet modifikovaných silanolových skupin c (µmol/m2):
kde SA je specifický povrch nosiče (m2/g), %C je procentický obsah uhlíku, který se získá elementární analýzou, nC je počet atomů uhlíku v molekule silanu (ligandu) a MW je molekulová hmotnost silanu použitého k chemické modifikaci nosiče.
Silikagel s volnými hydroxylovými skupinami obsahuje asi 8 µmol/m2, ale ze stérických důvodů může zreagovat pouze asi polovina těchto volných silanolových skupin a chemicky lze tak vázat asi 4 µmol/m2 silanu na povrchu silikagelu. Silanizační činidlo je poměrně objemné a čím objemnější je molekula silanu a čím delší ligand obsahuje, tím se dosáhne nižšího pokrytí povrchu nosiče (silikagelu) chemicky vázanou fází. Nezreagované silanolové skupiny jsou tedy částečně stíněny sousedními ligandy nebo mohou být přítomny separovaným molekulám. Nepolární fáze jsou zcela hydrofobní, jejich povrch se nesmáčí vodou a nesmí obsahovat žádné silanolové skupiny přístupné molekulám vzorku. Na náplních s nepolární fází musí být retenční objemy polár-ních látek prakticky rovné mrtvému objemu kolony, retenční objemy nepolárních látek na nepolárních fázích rostou s rostoucí délkou ligandu (alkylového řetězce) a celkovým obsahem chemicky vázaného uhlíku (zvětšuje se objem stacionární fáze).
Další související odkazy:
2. Kolony na bázi oxidu zirkoničitého
4. Vliv aktivity zbytkových silanolových skupin
[1]. Hara S., Ohnishi S.: J. Liq. Chromatogr. 7, 59 (1984).
[2]. Karch K., Sebestian I., Halász I.: J. Chromatogr. 122, 3 (1976).
Last modified:
