V případě zachování stejné stacionární (související odkaz) a složení mobilní fáze fáze je převod metody HPLC na metodu UPLC jednoduchý, vycházející z několika základních chromatografických rovnic. Při převodu metody je třeba změnit objemový průtok, velikost nástřiku a dobu analýzy (gradientový čas/tabulka).

Objemový průtok

Za předpokladu zachování stejného lineárního průtoku mobilní fáze pro objemový průtok platí:

kde d_HPLC je vnitřní průměr HPLC kolony a d_UPLC je vnitřní průměr kolony pro UPLC. Obdobně pak pro objemový průtok F.

K výpočtu je možné použít tento kalkulátor.

Gradientový profil

Gradientový profil (gradientová tabulka) se může upravit podle následující rovnice:

kde L_HPLC je délka HPLC kolony a L_UPLC je délka kolony pro UPLC. tG je pak čas pro každý gradientový krok.

Objem nástřiku

Objem nástřiku na UPLC kolonu se sníží podle jednoduché rovnice:

kde Vinj je objem nástřiku na UPLC resp HPLC kolonu. Ostatní symboly mají stejný význam jako v předchozích rovnicích. K výpočtu je možné použít kalkulátoru.

Objem nástřiku má vliv na účinnost separace (N). Při objemu nástřiku 20 µl na kolonu o rozměrech 150x4,6 mm zaujme tento nástřik objem 0.8 %. Proto by stejný objem měl zaujmout nástřik na kolonu UPLC. V případě použití kolony o rozměrech 2,1x50 mm pak musí být nástřik cca 1,4 µl – v tomto případě zaujme stejný objem. Kdyby byl použit nástřik 20 µl pak zaujme asi 12 % objemu kolony:

Na účinnost kolony má vliv velikost nástřiku zejména u mikrokolon. Vliv velikosti nástřiku na účinnost kolony je diskutována zde.

Optimalizovaný průtok

Protože pracuje UPLC za vyšších lineárních rychlostí než klasická HPLC, pak pro optimalizovanou objemovou rychlost F2_UPLC (která bude s největší pravděpodobností vyšší než F_UPLC) bude plati pro optimalizovaný gradientový čas (dobu analýzy) tG2_UPLC:

Příklad

Původní HPLC metoda má tyto podmínky: vnitřní průměr kolony HPLC 4.0 mm, délka kolony 250 mm, průtok mobilní fáze 1 ml/min a objem nástřiku 10 µl, doba analýzy 60 minut. UPLC metoda pracuje na koloně o stejné stacionární fázi délky 100 mm, vnitřního průměru 2.1 mm. Jaký bude objemový průtok mobilní fáze, doba analýzy a objem nástřiku pro UPLC metodu?

Řešení

pro objemový průtok F_UPLC platí: (2.1/4.0)²*1 = 0.28 ml/min.

pro objem nástřiku Vinj_UPLC platí: (2.1/4.0)²*(100/250)*10 = 1.1 µl.

pro dobu analýzy tG_UPLC platí: (100/250)*60 = 24 min.

Objemový průtok F_UPLC 0.28 ml/min byl optimalizován na F2_UPLC = 0. 5 ml/min. Pro dobu analýzy tG2_UPLCplatí: (0.28*24)/0.5 = 13.4 min.

Korekce na mrtvý objem systému - dwell volume

Protože každý chromatografický systém má jiný mrtvý objem (viz také zde), musí se tento mrtvý objem korigovat tak, aby nedošlo ke "zpoždění" gradientu na počátku kolony:

Časová korekce pro vypočtený optimalizovaný průtok se vypočte podle rovnice:

kde Dwel_hplc je mrtvý objem HPLC systému (ml), Dwel_uplc je mrtvý objem UPLC systému (ml), VC_hplc je objem kolony HPLC (ml), VC_uplc je objem kolony UPLC (ml).

Příklad

Převod ze systému HPLC o objemu Dwel_hplc = 1,2 mL na UPLC o objemu Dwel_uplc = 0,11 mL. Původní kolona: 4,6 x 150 mm, UPLC kolona: 2,1 x 5,0 mm. Průtok na UPLC koloně je 0,4 ml/min. Vypočtený objem kolony VC_hplc = 2,49 mL, objem kolony UPLC VC_uplc = 0,17 mL. Pak dosazením do rovnice dostaneme:

O vypočtený čas tj. – 0,07 min musí být nový gradient „pozdržen“ abychom dostali stejné chromatografické podmínky jako v původním systému.

Související odkazy:

Kalkulátor pro přenos metody

HPLC column selection by USP listing

[Top of Page]

Last modified: