Vyhodnocování výsledků v HPLC
K identifikaci látek v HPLC se používá retenčních časů nebo retenčních objemů. Pro účely identifikace se stupnice retence kalibruje pomocí tzv. retenčních indexů I (cit.[1] ). Tento způsob kalibrace byl navržen pro plynovou chromatografii pro kalibrační standardy n-alkany, v kapalinové chromatografii se tyto standardy nepoužívají.
Úkolem kvantitativního stanovení je nalezení vztahu mezi plochou nebo výškou píku a množstvím eluované látky. Plochy píků lze nejpřesněji vyhodnotit pomocí digitálních integrátorů nebo řídící datastanicí, použití planimetrie a triangulace je již historií. Největší chyba vyhodnocení chromatografického píku spočívá v přesném určení základní linie na chromatogramu.
Určení plochy resp. výšky píku je základem pro kvantitativní vyhodnocení sledované látky a platí, že nepřesné určení plochy resp. výšky píku je nejčastějším zdrojem chyb při zpracování chromatografických dat. Platí, že metoda, která byla použita pro vyhodnocení plochy resp. výšky standardu musí být použita i pro vyhodnocení plochy resp. výšky stanovované látky. Plochy resp. výšky píku lze nejpřesněji určit pomocí digitálních integrátorů nebo pomocí software pro vyhodnocení chromatografických dat. Každý software pak obsahuje řadu způsobů integrace, který je pak možné zvolit k optimalizaci integračních událostí (tangential skim, set liftoff, valley to valley atd.). Podrobnosti ke způsobu integrace můžete nastudovat zde.
Při kvantitativním způsobu vyhodnocení se většinou používají metody z oblastí instrumentální analýzy: metoda vnějšího standardu, metoda standardního přídavku, metoda vnitřního standardu a metoda vnitřní normalizace. Způsob použité techniky závisí na konkrétních podmínkách metody, snahou je použít pokud možno co nej-přesnější a nejjednodušší metodu vyhodnocování.
HPLC metoda stanovení má z hlediska vyhodnocení naměřených veličin relativní charakter, to znamená, že závislost mezi naměřenou plochou nebo výškou píku a koncentrací stanovované složky ci je třeba určit empiricky pomocí standardů. Nepoužívanější způsob je metoda kalibrační křivky. Při metodě kalibrační křivky se analyzuje série standardů o známé, ale různé koncentraci cS a hledá se závislost kalibrační funkce X = fK(c). Neznámý obsah stanovované složky se pak určí pomocí analytické vyhodnocovací funkce c = fA(X).
Budeme-li používat k vyhodnocení koncentrace plochu píku A, pak rovnice bude mít tvar
|
Je-li statisticky ověřené, že kalibrační přímka prochází počátkem (a = 0):
|
pak můžeme použít k vyhodnocení metodu porovnání s jedním vnějším standardem. Stanovovanou koncentraci je možné vypočítat podle vztahu
|
kde Ai je plocha stanovované látky o neznámé koncentraci ci, plocha standardu AS se získala proměřením tohoto standardu o koncentraci cS.
Použití metoda kalibrační křivky je oprávněné v případě, že všechny vzorky a standardy jsou si svými vlastnostmi rovnocenné, tzn. že můžeme zanedbat vliv matrice vzorku. Riziko vzniku chyb se v těchto případech snižuje použitím metod standardních přídavků, tj. metod porovnávání analytického signálu vzorku se signálem, získaným po přidání známých přídavků standardů stejného druhu jako je stanovovaná látka. Předpokladem použití metody standardního přídavku je splnění podmínky linearity mezi plochou píku a stanovovanou koncentrací. Princip této metody je v tom, že se ke vzorku přidá přesné množství té samé látky u které se má stanovit neznámá koncentrace. Vždy se musí udělat nejméně dva nástřiky vzorku – při prvním se dávkuje přesné množství vzorku, při druhém se dávkuje přesné množství směsi. tato technika má několik variant.
U metody standardního přídavku se musí provést dvě analýzy. První analýzou známého objemu vzorku Vi o neznámé koncentraci látky ci dostaneme plochu píku Ai. Ke vzorku se přidá známý objem standardu Vs o známé koncentraci standardu cs a po analýze dostaneme plochu píku Ais. Platí následující rovnice pro neznámou koncentraci ci:
|
Je-li splněna podmínka Vi >> Vs (poměr Vi/Vs = 1000), pak můžeme napsat:
|
Metoda jednoho standardního přídavku snižuje riziko systematických chyb, ale naopak může být zdrojem náhodných chyb. Tyto chyby částečně odstraňuje metoda jednoho standardního přídavku s dvěma roztoky, kdy se pracuje při konstantním celkovém objemu nebo metoduvíce standardních přídavků.
Měřením plochy píku před a po přídavku dvou a více standardních přídavků ke vzorku analytu umožňuje stanovit koncentraci stanovované složky použitím extrapolace regresní přímky závislosti měřené plochy A ze změn koncentrace Dc od záporné oblasti, přičemž musí být splněna podmínka linearity. Jednotlivé postupy vyhodnocení se liší podle toho, zda jsou jednotlivé přídavky konstantní, pracuje-li se při konstantním nebo proměnlivém objemu a přidává-li se vzorek ke standardu či naopak.
Připraví se série roztoků, ze kterých každý obsahuje stejný podíl vzorku o objemu Vi o neznámé koncentraci ci. K jednotlivým roztokům se přidá N objemových jednotek standardu VS (N = 0,1,2,…) o koncentraci cs. Všechny roztoky se doplní na stejný objem Vis a změří se plocha píku. Pak platí:
|
Rovnice je rovnicí přímkové závislosti, kdy směrnice b a posunutí a se určí graficky nebo výpočtem metodou nejmenších čtverců. Úsek na ose úseček je mírou stanovované koncentrace ci.:
|
Přednost této techniky je v tom, že se celá analýza uskuteční v jediném nástřiku a dávkovaný objem vzorku není třeba přesně odměřovat. Princip metody je dán tím, že se naředí vzorek vzorkem standardu přičemž původní koncentrace standardu musí být známá. Uvedená technika má dvě varianty a to metoda přímého porovnání a metoda kalibrační křivky. Známe dvě metody - přímého porovnání nebo kalibrační přímky.
Metoda přímého porovnání – postup: Ke vzorku o objemu Vi a neznámé koncentraci ci přidáme definovaný objem standardu Vs o známé koncentraci cs, přičemž platí i ¹ s, látky se musí dobře separovat a standard by se měl eluovat v blízkosti stanovované látky. Získaná směs se nadávkuje a vyhodnotí se plochy standardu As a stanovované látky Ai. Pak pro koncentraci vzorku platí:
|
kde RIS je relativní odezva detektoru stanovované látky vůči vnitřnímu standardu.
Metoda kalibrační přímky – postup: Připravíme se sérii standardních roztoků látky x o koncentrací cxi (i = 1,2, …) a z jednotlivých roztoků odebereme objem Vxi a naředíme jej objemem Vsi standardu S o známé koncentraci csi, přičemž platí x ¹ s. Získaná směs se nadávkuje a vyhodnotí se plochy standardu As a stanovované látky Ax. Pak pro kalibrační přímku platí:
|
K objemu vzorku Vx přidáme objem standardu Vs o koncentrací cs a směs se nadávkuje. Najde se plocha Ax a As, vypočte se hodnota výrazu (Ax/As).(Vs/Vx).cs a z kalibrační přímky se odečte hodnota pro koncentraci cx.
Princip této metody vychází z rovnice:
|
a v případě, že jsou známy odezvové faktory CRFx a CRFi, pak je výpočet velmi jednoduchý. Základním nedostatkem této metody je nutnost znalosti všech odezvových faktorů a to znamená úplnou identifikaci chromatogramu. Dalším nedostatkem je, že dostáváme pouze namísto koncentrace pouze bezrozměrné číslo, udávající procentové zastoupení určité složky ve vzorku. Existují další omezení, které vylučují použití této metody vyhodnocení: - některé komponenty nejsou eluovány nebo jsou nedetekovatelné, některé komponenty se nedělí dostatečně (nedají se určit jejich plochy) nebo jsou některé složky neidentifikovatelné.
Související odkazy:
Mez detekce a mez stanovitelnosti
[1] Kováts E.: Helv. Chim. Acta 41, 1915 (1958).
Last modified: