Chemiluminiscenční HPLC detektory
Při chemiluminiscenční (CL) detekci je využívána fluorescence, která je vyvolaná chemickou reakcí. Obecně se pod pojmem luminiscence rozumí vyzáření světla při přechodu molekuly z excitovaného stavu do stavu základního. Luminiscenci lze zjednodušeně rozdělit podle energie, kterou je luminiscence vybuzena (např. fotoluminiscence, chemiluminiscence, elekroluminiscence atd.) nebo podle doby dosvitu po odstranění zdroje excitace (fluorescence 10-8 – 10-2 s, fosforescence 10-2 s až dny). Fluorescenční detektory jsou v HPLC používány poměrně často už řadu let a pod označením fluorescenční detektor se rozumí prakticky pouze tento detektor. Naproti tomu, chemiluminiscenční detektory jsou v HPLC používány významně kratší dobu a jejich rozšíření je také významně menší. Teoretické zákonitosti, principy i aplikace již byly popsány [1],[2].
Typy chemiluminiscenčních detektorů pro HPLC
Z chemiluminiscenčních (CL) HPLC detektorů jsou prakticky známy pouze tři typy, a to detektor specifický pro dusík (Chemiluminescent Nitrogen Detector, CLND), CL detektor specifický pro síru (Chemiluminescent Sulphur Detector, CLSD) a univerzální CL detektor. CLN a CLS detektory jsou vyráběny i jako detektory pro plynovou chromatografii. Vzhledem k tomu, že jejich princip je založen na reakcích v plynné fázi, je jejich rozšíření v oblasti plynové chromatografie daleko větší, než v oblasti chromatografie kapalinové. Konstrukčně jsou CL detektory velmi jednoduché, protože nepotřebují žádný zdroj záření a detekují pouze emitované záření.
1. Chemiluminiscenční detektor specifický pro dusík
Princip chemiluminiscenčího detektoru specifického pro dusík je založen na známé a v analytické chemii často používané chemické reakci:
|
Vlnová délka emitovaného světla leží v červené a infračervené oblasti spektra (600 – 3200 nm). Intenzita emitovaného záření je přímo úměrná koncentraci NO. Druhou chemickou reakcí, kterou CLND využívá, je oxidační spalování efluentu, kdy za specifických podmínek z jednotlivých atomů vznikají jejich oxidační produkty, v případě dusíku pak oxid dusnatý.
|
Princip práce chemiluminiscenčního detektoru je dobře patrný z obrázku č.1. Efluent je rozprašován sprejem do pyrotrubice, ve které za specifických podmínek dochází k jeho oxidačnímu spalování. Část zplodin je pomocí vakua odsávána přes nafionovou sušící kapiláru do detekční cely, do které je přiveden ozón. Ten v případě přítomnosti oxidu dusnatého způsobí jeho oxidaci na oxid dusičitý v excitovaném stavu. Emitovaný foton je poté detekován fotonásobičem.
|
|
Odezva u CLND je přímo úměrná koncentraci dusíku v efluentu. Pro odezvu pak platí:
|
kde R je odezva detektoru, k je konstanta úměrnosti, CN vyjadřuje koncentraci dusíku v mobilní fázi, wN je hmotnostní zlomek dusíku v molekule analytu a C je koncentrace analytu. Chemiluminiscenční reakce využitá u CLND je vysoce specifická, z čehož plyne, že chemiluminiscenční emise je specifická pro dusík. Sloučeniny, které dusík neobsahují, neposkytují tedy žádnou odezvu.
2. Chemiluminiscenční detektor specifický pro síru
Činnost chemiluminiscenčího detektoru specifického pro síru je založena na následující chemické reakci:
|
Vlnová délka emitovaného světla leží v UV oblasti (200 – 400 nm). Intenzita emitovaného záření je přímo úměrná koncentraci H2S. Druhou a třetí chemickou reakcí, kterou detektor využívá, je oxidační spalování efluentu vedoucí k převedení molekul obsahujících síru na oxid siřičitý a jeho následná redukce na sirovodík. Schematicky se tyto reakce dají napsat jako
|
3. Univerzální chemiluminiscenční detektor
Univerzální CL detektor, stejně jako oba předchozí typy CL detektorů, detekuje emitované záření, které je vyvovalé reakcí mezi analytem (A) a činidlem (R) za vzniku excitovaného nestabilního meziproduktu AR*. Tento meziprodukt přechází na konečný stabilní derivát, přičemž je emitováno záření, které je následně detekováno:
|
Tato reakce probíhá za chromatografickou kolonou obdobně jako klasické derivatizační reakce. Nevýhodou je snížení separační účinnosti vlivem mrtvého objemu, který je vřazen do chromatografického systému. Na druhé straně, neexistují téměř žádná omezení ohledně mobilní fáze a jejího průtoku. Výtěžek chemiluminiscence závisí na řadě faktorů jako je teplota, rozpouštědlo, použité katalyzátory, koncentrace činidel, iontová síla pufrů a přítomnost dalších látek.
Jako derivatizační činidla lze použít celou řadu látek, jejichž reakce s analytem je založena na oxidační nebo redukční reakci poskytující excitovaný fluorofor produku-jící luminiscenční záření. Většina těchto látek je velmi reaktivní, a proto musí být ge-nerovány in-situ těsně před reakcí s analytem. Generaci in-situ lze uskutečnit:
chemickou cestou
elektrochemickou generací
fotochemickou generací
Výrobci chemiluminiscenčních detektorů pro HPLC
[1] A.M. García-Campana, W.R.G. Baeynes (Eds), Chemiluminiscence in Analytical Chemistry, Marcel Dekker, New Yourk, 2001.
[2] N.D. Danielson, in: J.A. Bard (Ed.), Electrogenerated Chemiluminiscence, Marcel Dekker, Inc. New York, 2004.
Last modified: