- výbojka (rtuťová nebo xenonová)
- excitační mřížka (monochromátor)
- štěrbina
- průtoková cela
- mikročočky
- cut-off filtr
- emisní mřížka (monochromátor)
- fotonásobič
Fluorescenční HPLC detektory
Fluorimetrické detektory jsou založeny na principu fluorescence a měření sekundárního záření (emisního), které látka vydá po absorpci primárního elektromagnetického záření (excitačního). Doba trvání fotoluminiscence bývá u fluorescence 10-8 až 10-5 sekundy. Absorbcí elektromagnetického záření přecházejí molekuly látek ze základního singletového elektronového stavu (základní vibrační stav) do různých vibračních hladin excitovaného singletového elektronového stavu. Absorbovanou energii může excitovaná molekula opět vyzářit jako fluorescenci nebo ji přeměnit zcela jiným mechanismem na energii vibrační nebo ji předat jiným molekulám. Ztrátou vibrační energie přejde molekula nejprve do základního vibračního stavu a pak emituje fluorescenční záření, které má stejnou vlnovou délku jako absorbované záření (rezonanční fluorescence) nebo častěji je vlnová délka emitovaného záření větší v důsledku vibrační relaxace.
Konstrukce fluorimetrického detektoru umožňuje zachycení maximálního množství fluorescenčního záření vznikajícího v cele detektoru násobičem, přičemž toto čidlo musí být chráněno před dopadem excitačního záření. Tohoto se dosahuje kombinací interferenčních filtrů a násobič je umístěn kolmo na zdroj excitačního záření. Fluorimetrické detektory (schéma) jednoduché konstrukce používají rtuťové výbojky a interferenční filtr jako zdroj monochromatického excitačního záření a detekují fluorescenční záření současně při všech vlnových délkách po oddělení zbytku rozptýleného excitačního záření. Fluorimetrické detektory moderní konstrukce umožňují nastavit délku excitačního i emitovaného záření použitím monochromátoru, současně lze programovat tyto vlnové délky v průběhu eluce k dosažení maximální citlivosti pro každou separovanou látku.
Fluorimetrické detektory umožňují měřit v průtokové kyvetě detektoru excitační fluorescenční spektra při konstantní vlnové délce emitovaného fluorescenčního záření, nebo emisní fluorescenční spektra při nastavené vlnové délce excitačního záření. Měření spekter se uskutečňuje buď v systému "stop-flow" nebo u některých detektorů i bez zastavení toku mobilní fáze a jsou pak obdobou detektorů diodového pole spektrofotometrických detektorů.
Závislost mezi intenzitou fluorescence a koncentrací fluoreskující látky vystihuje přibližný vztah:
který platí pro nízké koncentrace fluoreskující látky a vrstva roztoku (l) je dostatečně tenká. Závislost mezi fluorescenčním tokem FF a koncentrací fluoreskující látky vyjadřuje (obrázek). Z obrázku je patrné, že křivka je lineární pouze v nízkých oblastech koncentrace c, se zvětšující se koncentrací c se asymptoticky blíží hodnota fluorescenčního toku hodnotě FF,max.
Last modified: