Vliv aktivity zbytkových silanolových skupin

I nejlépe připravená chemicky vázaná stacionární fáze obsahuje zbytkové polární silanolové skupiny jejichž obsah se pohybuje kolem 4 mmol/m2 a typický obsah ligandových skupin se pohybuje někde kolem 3,5  £ mmol/m2, tím pádem obsahuje více „residuálních“ silanolových skupin než ligandů. Ačkoli většina těchto silanolových skupin není stéricky dostupná chromatografovaných látkám, jsou ještě dostatečně přístupné pro interakce s analytem a mobilní fází (vodíkové vazby, dipól-dipólové interakce, iontově-výměnné) a toto je potom příčinou stoupající retence a chvostování píků polárních, zejména bazických látek. Iontově-výměnné reakce zbytkových silanolových skupin jsou dominující pro interakce s bazickými látkami a jsou funkcí pH mobilní fáze. Se stoupajícím pH mobilní fáze roste vliv zbytkových silanolových skupin, protože roste jejich počet s negativním nábojem (pH 6-8). Proto se v praxi používá eliminace nepolární fáze tj. minimalizování interakce bazických látek s volnými silanolovými skupinami (a tím minimalizace tailování píků) a tím i nutnost zvyšování obsahu chemicky vázaného uhlíku v nepolární fázi (carbon load). Existuje několik způsobů eliminace, které budou popsány dále.

Endcapping

Endcapping je fyzikálně-chemický proces, který redukuje počet volných silanolových skupin na nepolární fázi (na bázi silica) chemickou reakcí např. s trialkylchlorsilanem (alkyl - methyl). Trimethylchlorsilan jako menší molekula než trioktadecylchlrosilan pokryje stéricky bráněné volné silanolové skupiny (obrázek).

 

Grafické znázornění endcappingu

Stérické stínění volných OH skupin

Eliminace silanolových skupin stérickým odstíněním při přípravě chemicky vázaných fází, tj. přípravou fází s delším organickým uhlíkovým řetězcem a zvýšením obsahu vázaného uhlíku v nepolární fázi (carbon load), s tímto však současně roste i retence látek. Dokonalé stérické odstínění zbytkových -OH skupin lze docílit použitím objemných alkyl substituentů R1, R3 -diisobutyl nebo diisopropyl. Jako příklad lze uvést stacionární fázi Zorbax StableBond (Agilent, USA):

Výhodou těchto stacionárních fází je vysoká stabilita vůči nízkým pH mobilní fáze (~1) a mobilní fázím obsahující trifluoroctovou kyselinu, je stabilní při teplotě až 90 °C a při použití 100 % vodné mobilní fáze nedo-chází ke kolapsu této fáze.

Modifikace ligandu

Začleněním polární skupiny do organického uhlíkového řetězce stacionární fáze mezi povrch silikagelu a nepolární vrstvy (ligand) např. karbamátové skupiny - reverzní fáze SymmetryShield RP8 nebo Supelcosil  ABZ+:

Tento krok zmírňuje interakci analytu s povrchovými volnými silanolovými skupinami, zejména bazických polárních látek. Pravděpodobně dochází k interakci mírně polární skupiny s volnými silanolovými skupinami a zvýšením polarity nepolární fáze dochází ke zvyšující se adsorpci vody v mobilní fázi.

pH a složení mobilní fáze

Z popisu chování silanolových skupin k mobilní fázi je zřejmé, že tyto můžeme eliminovat i úpravou pH mobilní fáze a to přídavkem organických aminů do mobilní fáze. Ty soutěží s analytem o aktivní centra zbytkových silanolových skupin a eliminují tak jejich chování. Nejčastěji se používá triethylamin, pokud je triethylamin nedostačující, používá se trioctylamin nebo cetyltrimethylamonná sůl. Použití cetyltriethylaminu je velmi efektivní, ale prodlužuje se doba ekvilibrace kolony a retenční čas chromatografovaných látek. pH takto připravené mobilní fáze se musí upravit na hodnotu pH 2-7, jinak dochází k rozpouštění silikagelu. Jako přídavek se používá kyselina fosforečná, octová nebo citronová, u cetyltrimethylamonné soli se pH upravovat nemusí. Model je graficky zobrazen na obrázku.

Eliminace volných silanolových skupin přídavkem organického aminu do mobilní fáze

Z komerčně dostupných náplní s chemicky vázanými fázemi lze uvést nepolární fáze s alkylovými řetězci různé délky (C2-C18), s fenylovými a difenylovými skupinami, které mají zvýšenou polaritu a rozdílnou selektivitu zejména k fenolům a aminosloučeninám. Střední polaritou se vyznačují fáze nitrilové (alkylnitrily) a amidové, které se vykazují zvýšenou selektivitou k fenolům, cukrům a alkoholům. Aminové fáze mají slabé vlastnosti iontoměniče (anexu).

 

Polymerní stacionární fáze

Hlavní a podstatnou nevýhodou chemicky modifikovaného silikagelu je jeho rozpustnost v alkalické oblasti pH a mnoho chromatografických systémů by rádo upřednostnilo alkalickou oblast pH zejména pro separaci bazických látek. Tomuto požadavku vyhovují polymerní stacionární fáze, které jsou většinou kompatibilní v celém rozsahu pH. Nevýhodou polymerních fází je, že částečky obsahují mikropóry o velikosti asi 1 nm, což zabraňuje přenosu hmoty zejména pro malé molekuly. Polymerní stacionární fáze jsou dále omezeny maximálním pracovním tlakem na koloně a to 20 MPa i když 10 MPa je pro většinu aplikací HPLC dostačující. Stabilita polymerních stacionárních fází je omezena stabilitou funkčních skupin polymeru – pro methylakrylát je limitující stabilita esterové skupiny, pro akrylamid je limitující stabilita amidové skupiny. I když současně připravované polymerní fáze jsou dostatečně mechanicky i chemicky stálé, pro jejich nižší účinnost dosud nevytlačily z použití chemicky vázané nepolární stacionární fáze.