<html>

<head>
<meta http-equiv=Content-Type content="text/html; charset=windows-1250">
<meta name="keywords" content="HPLC, teorie, chromatografie, disociace">

<title>Vliv pH mobilní fáze na retenci solutů</title>

<style>
<!--body
	{scrollbar-face-color: #FF0000;
	scrollbar-shadow-color: #00FFFF;
	scrollbar-highlight-color: #00FFFF;
	scrollbar-3dlight-color: #00FFFF;
	scrollbar-darkshadow-color: #00FFFF;
	scrollbar-track-color: #0000FF;
	scrollbar-arrow-color: #00FFFF;}

 /* Font Definitions */
 @font-face
	{font-family:Tahoma;
	panose-1:2 11 6 4 3 5 4 4 2 4;}
 /* Style Definitions */

h1
	{margin-top:5.0pt;
	margin-right:0.2cm;
	margin-left:0.2 cm;
	text-align:justify;
	line-height:200%;
	font-size:10.0pt;
	font-family:Tahoma;
	font-weight:normal;}
h2
	{margin-top:6.0pt;
	margin-right:0.2cm;
	margin-left:0.2cm;
	text-align:justify;
	line-height:150%;
	font-size:12.0pt;
	font-family:Tahoma;
	font-weight:bold;
	color:blue;}
h3
	{margin-top:5.0pt;
	margin-right:0.2cm;
	margin-left:0.2cm;
	text-align:justify;
	line-height:150%;
	font-size:10.0pt;
	font-family:Tahoma;
	font-weight:bold;
	color:blue;}
h4
	{margin-top:5.0pt;
	margin-right:0.2cm;
	margin-left:0.2cm;
	text-align:justify;
	line-height:150%;
	font-size:10.0pt;
	font-family:Tahoma;
	font-weight:bold;
	color:red;}
h5
	{margin-top:5.0pt;
	margin-right:0.2cm;
	margin-left:0.2 cm;
	margin-bottom:5.0pt;
	text-align:justify;
	line-height:175%;
	font-size:8.0pt;
	font-family:Tahoma;
	font-weight:normal;}

h6
	{margin-top:6.0pt;
	margin-right:0.2cm;
	margin-left:0.2cm;
	text-align:justify;
	line-height:150%;
	font-size:8.0pt;
	font-family:Monotype Corsiva;
	font-weight:bold;
	color:red;}


-->
</style>

<script language="JavaScript">
<!--
function HighlightAnchor()
{
    if (window.event.srcElement.tagName == "A") 
        window.event.srcElement.style.color = "orange";
}

function LowlightAnchor()
{
    if (window.event.srcElement.tagName == "A") 
        window.event.srcElement.style.color = "blue";
}
// -->
</script>
</head>

<body lang=CS link=blue vlink=purple onmouseover="HighlightAnchor()"
onmouseout="LowlightAnchor()">

<a name="_top">

<h2>Vliv pH mobilní fáze na retenci solutů</h2>

<h1>Silně polární a iontové látky na nepolárních fázích se zadržují velmi málo nebo vůbec ne a eluují v mrtvém objemu kolony nebo dříve, než odpovídá mrtvému objemu kolony - což je jev tzv. iontové výluky. Pro látky iontové povahy proto můžeme jejich chromatografické chování ovlivnit volbou pH mobilní fáze, kdy změnou pH mobilní fáze dochází k potlačení disociace slabých kyselin (pH &lt; 7) či slabých bází (pH &gt; 7). Potlačením disociace (</span></a><a href="#_stupen_disociace"><span style='font-family:Tahoma'>obrázek</span></a><span style='font-family:Tahoma'>) dochází ke zvýšení retence a zamezení chvostování píku dané chromatografované látky. Pro organické kyseliny dochází k potlačení disociace snížením pH na hodnotu asi pH 2-5, pro organické báze dochází k potlačení disociace zvýšením pH na hodnotu asi pH 7-8, ale toto pH je omezeno rozpouštěním silikagelu při pH &gt; 8,5. Selektivita pro karboxylové kyseliny na reverzní fázi je závislá na použité mobilní fázi (její pH) a na použité reverzní fázi. V&nbsp;reverzních stacionárních fázích závisí retence jednosytné kyseliny HA na pH a na disociační konstantě karboxylové kyseliny <i>K</i><sub>a</sub>:</h1>

<td width=100%>
  <p align=center><img border=0 src="Figure/equat36.gif"></p>
  </td>


<h1>kde</h1>

<td width=100%>
  <p align=center><img border=0 src="Figure/equat37.gif"></p>
  </td>


<h1><i>k</i><sub>0</sub> a <i>k</i><sub>-1</sub>jsou retenční faktory neionizované a ionizované formy a <i><span style='font-family:Symbol'>a</span></i> je stupeň disociace (frakce ionizovaných molekul). Obdobně pro selektivitu bazí na reverzní fázi platí stejná rovnice kde </h1>

<td width=100%>
  <p align=center><img border=0 src="Figure/equat38.gif"></p>
  </td>


<h1>Zvýšení retence a zlepšení symetrie píků ionizovaných látek se může dosáhnout přídavkem neutrálních solí do mobilní fáze - tzv. vysolovací efekt.<sup><a href="#_edn1" name="_ednref1">[1]</a></sup></h1>


<td width=100%><p align=center><a name="_stupen_disociace"></a><span
style='font-size:10.0pt;font-family:Tahoma;color:red'><b>Závislost stupně disociace na pH
(kyselina sorbová (___) pK<sub>a</sub> = 4,76 a benzoová (---) pK<sub>a</sub> = 4,19)</b></span></p>
 </td>

<td width=100%>
  <p align=center><img border=0 src="Figure/alfa.gif"></p>
  </td>

<h1>V případě, že se získá lineární závislost kapacitního poměru <I>k</I> na stupni disociace <span style='font-family:Symbol'>a</span> (v lineární oblasti závislosti stupně disociace <span style='font-family:Symbol'>a</span> na pH solutu) pak pro <I>k</I><sub>0</sub> a <I>k</I><sub>-1</sub> platí:</h1>  

<td width=100%>
  <p align=center><img border=0 src="Figure/k0_alfa.png"></p>
  </td>
<td width=100%>
  <p align=center><img border=0 src="Figure/k1_alfa.png"></p>
  </td>

<h1>Určením koeficientů <I>k</I><sub>0</sub> a <I>k</I><sub>-1</sub> je možné predikovat chování solutů při změně pH mobilní fáze. Jestliže platí <I>k</I><sub>-1</sub> ≠ <I>k</I><sub>-1</sub> pak změnou pH můžeme ovlivnit sepraci solutů (selektivitu systému). Experimentální hodnoty kapacitních poměrů kyseliny benzoové a sorbové při separaci na reverzní fázi C18 získané při různém pH mobilní fáze (pH 3,5 - 4,5) jsou zpracovány graficky:</h1> 

<td width=100%>
  <p align=center><img border=0 src="Figure/alfa_k_BA_SA.png"></p>
  </td>

<h1>Ze získaných experimentálních dat byly vypočteny kapacitní faktory <I>k</I><sub>0</sub> a <I>k</I><sub>-1</sub> pro kyselinu benzovou (<I>k</I><sub>0</sub> = 6,10; <I>k</I><sub>-1</sub> = 1,23) i sorbovou (<I>k</I><sub>0</sub> = 5,81; <I>k</I><sub>-1</sub> = 0,73). Při pH 4,5 je selektivita systému nejvyšší a kapacitní poměr získaný experimentálně pro kyselinu benzoovou je 2,84 (výpočtem pak 2,83), kapacitní poměr získaný experimentálně pro kyselinu benzoovou je 4,04 (výpočtem pak 4,01). Experimentální a vypočtená data jsou tak ve výborné shodě. </h1> 

<h1>Pro eluční poměr (selektivitu) r<sub>2,1</sub> můžeme odvodit rovnici:</h1> 

<td width=100%>
  <p align=center><img border=0 src="Figure/selektivita_alfa.png"></p>
  </td>

<h1>kde index ´´ značí kyselinu sorbovou a index ´ se vztahuje ke kyselině benzoové. Na základě této rovnice byl vypočten eluční poměr r<sub>2,1 (teor)</sub> = 1,42 což odpovídá experimentálně získanému elučnímu poměru r<sub>2,1 (exp)</sub> = 1,42.</h1> 

<h1>Jako příklad vlivu pH na separaci kyseliny salicylové (SA; pK<sub>a</sub>=2,98) a acetysalicylové (ASA; pK<sub>a</sub>=3,50) je ukázán na následujících obrázcích.</h1> 

<h3><p align=center><a name="_Obr_1"></a>Separace kyseliny salicylové a acetylsalicylové; pH 6.2</p></h3>

<tr> <td><p align=center><img border="0" src="Figure/asa_ph_9_2.png"></p></td> </tr>

<h3><p align=center><a name="_Obr_2"></a>Separace kyseliny salicylové a acetylsalicylové; pH 3.8</p></h3>

<tr> <td><p align=center><img border="0" src="Figure/asa_ph_3_8.png"></p></td> </tr>

<h3><p align=center><a name="_Obr_3"></a>Separace kyseliny salicylové a acetylsalicylové; pH 1.8</p></h3>

<tr> <td><p align=center><img border="0" src="Figure/asa_ph_1_8.png"></p></td> </tr>

<h4>Související odkazy</h4>

<h1><b><a href="../Tip/iont_suppres.htm" target=main>Potlačení disociace polárních látek</a></b></h1>

<h1><b><a href="../Tabs/calc_ion.html" target=main title="Otevřít ...">Jednoduchý kalkulátor</a></b> pro výpočet % ionizace kyselin a bazí...</h1>

<h3>Literatura</h3>
<hr size=2 width="33%" align=left>


<h5><a href="#_ednref1" name="_edn1">[1]</a>. Jandera P., Churáček J., Bartošová J.: Chromatographia <i>13</i>, 485 (1980).</h5>



&nbsp;
<h5><a href="#top">[Top of Page]</a></h5>
&nbsp;

<!--- LAST MODIFIED --->
<h6>Last modified: 
<script language="javascript">
<!--
   datum = new Date (document.lastModified);
   mesic = new Array ('ledna', 'února', 'března', 'dubna', 'května', 'června', 'července', 'srpna', 'září', 'října', 'listopadu', 'prosince');
   document.write (datum.getDate() + '. ' + mesic[datum.getMonth()] + ' ' + datum.getYear());
//-->
</script>
</h6>
<!--- LAST MODIFIED END--->

</body>
</html>�