Gradientová eluce je nejpoužívanější a neúčinnější technikou změny selektivity na analytické koloně. Při gradientové eluci se pracuje s mobilní fází, jejíž složení se mění s časem, takže v průběhu separace dochází ke zvyšování její eluční síly.[1] Většinou se pracuje s binární elucí, kdy jedna fáze má výrazně nižší eluční sílu než druhá. Časová změna koncentrace v průběhu separace se označuje jako profil gradientu.

Gradient může být spojitý (lineární nebo exponenciální) nebo gradient stupňovitý (viz obrázek). Spojitý gradient je charakterizován pomocí tří na sobě nezávislých parametrů - počáteční koncentrací j_B,0 účinné eluční složky v mobilní fázi, strmostí gradientu b_g, (směrnice udávající průměrnou velikost změny koncentrace účinné eluční složky na jednotku dávkovaného objemu eluentu v průběhu gradientu) a tvarem gradientu (přímkové, konvexní a konkávní).

Distribuční konstanta není konstantní a proto nelze základní chromatografické charakteristiky počítat pomocí rovnic pro isokratickou eluci.

Gradientová průběh je charakterizovaný gradientovými křivkami, které podle uzancí mají následující tvar:

Gradientová křivka 6 je tudíž lineární, křivka 1 a 11 znamenají skokovou změnu gradientu.

Pro retenční čas můžeme napsat:

kde b_g je strmost gradientu, k_a je kapacitní poměr v počátku eluce a t₀ je retenční čas nezadržované látky (pro sokratickou eluci stejné jako t_M). Retenční čas gradientové eluce klesá se strmostí gradientu.

Pro rozlišení můžeme napsat:

kde k_a1 a k_a2 jsou kapacitní poměry dvou separujících se látek v počátku gradientu. Z rovnice vyplývá, že rozlišení je závislé na strmosti gradientu a může být zvýšeno snížením strmosti gradientu b_g a naopak.

Konečně pro strmost gradientu můžeme napsat:

kde k_a a k_b jsou kapacitní poměry látky při počátečním složení a konečném složení gradientu. t_G je doba trvání gradientu.

Volba vhodného gradientu je obtížná a nejlépe se optimalizuje empiricky. Pro lineární gradient s počáteční koncentrací j_B,0 účinné eluční složky je retenční čas t_g,j daný rovnicí:

kde m je konstanta logaritmických závislostí kapacitního poměru na objemovém zlomku účinné eluční složky (více zde). Z rovnice je patrné, že se vzrůstající strmostí gradientu b_g a počáteční koncentrací účinné eluční složky j_B,0 se retenční čas snižuje.

Rozlišení a retenční čas lze ovlivnit následujícími postupy:

1. je-lirozlišení R_1,2 příliš malé nebo velké, snížíme resp. zvýšíme strmost gradientu b_g
2. jsou-li první látky eluovány příliš pozdě, lze jejich eluci urychlit zvýšením koncentrace j_B,0 účinné eluční složky
3. je-li rozlišení R_1,2 v určitém místě gradientu příliš malé, použije se nelineární gradient, který má méně strmý průběh a naopak

Gradientová eluce má vzhledem ke své specifičnosti určitá omezení:

1. gradientovou eluci nelze použít v chromatografii kapalina-kapalina, kde v průběhu eluce může dojít k vymývání stacionární fáze z kolony
2. při gradientu na polárních adsorbentech, kde se používá gradient s rostoucí koncentrací polárního rozpouštědla se polární složky přednostně sorbují z mobilní fáze, což vede ke špatné reprodukovatelnosti elučních dat
3. použití detektorů je omezeno na selektivní detektory, které nejsou citlivé na změny průtoku a složení mobilní fáze (UV-VIS, FLD)

Literatura

[1] Jandera P. Churáček J.: Gradient Elution in Column Liquid Chromatography. Elsevier, Amsterdam 1985.

[Top of Page]

Last modified: